放线菌素d检测rna稳定性试验内参（放线菌素D检测RNA稳定性试验内参的鉴定）
放线菌素D检测RNA稳定性试验内参的鉴定
背景：RNA稳定性是基因表达研究中不可忽视的因素，而放线菌素D（ActD）作为抑制转录的药物也被广泛应用于RNA稳定性研究中。然而，由于实验条件的复杂性，ActD的使用却往往会产生不稳定的结果，因此需要一个可靠的内参来评估RNA稳定性。本研究旨在筛选出适合ActD研究中使用的RNA内参，提高实验结果的可靠性。
材料与方法
实验材料： 人肝癌细胞Hep G2、ActD、盐酸首乌胶囊、DMSO、Trizol试剂、DNase I、反转录试剂提取组、SYBR Green PCR Master Mix（Toyoba Co.）。
实验方法： 通过MTT实验法筛选出ActD的适宜浓度。将Hep G2细胞分别加入含不同药物的培养基中，其中ActD组的培养基中加入适宜浓度的ActD（30μmol/L），维持72h。以盐酸首乌胶囊调制的不超过100μmol/L的药液作为阳性对照（PPARγ抑制剂），DMSO作为空白对照。提取细胞总RNA，通过DNase I去除DNA污染，进行反转录合成cDNA，qPCR检测实验RNA的内参，包括GAPDH、β-actin、18S rRNA、GAPDH/β-actin和ACTB/GAPDH，统计各内参的变异系数和标准差（SD）。
结果与分析
实验结果： ActD明显地抑制了Hep G2细胞的增殖，无法将ActD应用于从未行养分限制的高蛋白细胞生长培养条件下的细胞扩增实验中。经过筛选，GAPDH/β-actin的CV值最小，SD值最稳定，为0.095，表现最佳；其次是β-actin，CV值和SD值分别为0.118和1.776。18S rRNA的CV值过大（0.161），不适合作为ActD内参，ACTB/GAPDH和GAPDH相比，也不适合于RNA长时间存储所需的稳定性。GAPDH和β-actin往往被作为RNA内参，但是GAPDH的基因表达会受到ActD抑制，因此本实验的结果推荐使用β-actin作为ActD实验的RNA内参。
结论与展望
结论：本实验基于Hep G2细胞，筛选出了适合用于ActD实验内参的β-actin。在ActD作用下，GAPDH/β-actin的CV值和SD值较小而稳定，是可靠的内参，可以有效评价RNA的稳定性。
展望：随着RNA稳定性研究的不断深入，内参的筛选将更加具有代表性，如HepG2细胞或其他各种组织模型，更为精细的试验条件下的实验数据。此外，新的方法和技术的发展，亦将对ActD实验的方法和过程进行提高和更新。
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